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原核誘導表達課案

原核誘導表達的標準操作程序(SOP)

一.目的:

使本實驗室工作人員了解誘導表達的操作過程,并能實際動手進行原核誘導表達一系列實驗。

二.適用范圍:

本SOP適用于對新基因克隆的表達,并針對新基因產生的可溶性蛋白。

三.實驗原理:

E.coli的乳糖操縱子含Z、Y及A三個結構基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉移酶,此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白,后者與O序列結合,使操縱子受阻遏而處于關閉狀態。在啟動序列P上游還有一個代謝物基因激活蛋白(CAP)結合位點。由P序列、O序列和CAP 結合位點共同構成lac操縱子的調控區,三個酶的編碼基因即由同一調控區調節,實現基因產物的協調表達。在沒有乳糖存在時,lac操縱子處于阻遏狀態。此時,I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合,阻礙RNA聚合酶與P 序列結合,抑制轉錄起動。當有乳糖存在時,lac操縱子即可被誘導。在這個操縱子體系中,真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞,經b-半乳糖苷酶催化,轉變為半乳糖。后者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白,使蛋白構象變化,導致阻遏蛋白與O序列解離、發生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷(
IPTG)是一種作用極強的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩定,因此被實驗室廣泛應用。

E.coli的乳糖操縱子含Z、Y及A三個結構基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉移酶,此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白,后者與O序列結合,使操縱子受阻遏而處于關閉狀態。在啟動序列P上游還有一個代謝物基因激活蛋白(CAP)結合位點。由P序列、O序列和CAP 結合位點共同構成lac操縱子的調控區,三個酶的編碼基因即由同一調控區調節,實現基因產物的協調表達。在沒有乳糖存在時,lac操縱子處于阻遏狀態。此時,I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合,阻礙RNA聚合酶與P 序列結合,抑制轉錄起動。當有乳糖存在時,lac操縱子即可被誘導。在這個操縱子體系中,真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞,經b-半乳糖苷酶催化,轉變為半乳糖。后者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白,使蛋白構象變化,導致阻遏蛋白與O序列解離、發生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩定,因此被實驗室廣泛應用。

四、試劑準備:

(一)實驗器材的滅菌:

槍頭的滅菌:

1mL,200μL,20μL的槍頭放入槍頭盒,用報紙包住(2層),放入高壓滅菌鍋中滅菌,121℃,20min。80℃烘箱中烘干,常溫放置。

螺口管及離心管的滅菌:

將螺口管和離心管分別放入鋁制飯盒中(蓋子要擰松,離心管的管蓋打開),放入高壓滅菌鍋中滅菌,121℃,20min。80℃烘箱中烘干,常溫放置。

50mL離心管的滅菌:

將50mL離心管用報紙包住(2層),放入高壓滅菌鍋中滅菌,121℃,20min。80℃烘箱中烘干,常溫放置。

(二)LB培養基的配制

液體LB培養基(1L):蛋白胨10g

氯化鈉10g

酵母提取物5g 調PH值到7.5,高壓滅菌,4℃保存。

固體LB培養基(1L):蛋白胨10g

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